亲爱的小伙伴，久等了，接上集介绍转染基本含义，转染类型，转染方法以及避坑指南后，今天继续分享转染的详细操作步骤，常见问题及优势产品喔，详情如下：

一、以siRNA转染为例，具体步骤如下：

☆ 设计siRNA：首先，需要基于目标基因序列设计siRNA。可以使用在线工具或商业实验室进行设计。一般建议设计2-3条siRNA并进行验证，以确保特异性和有效性。

☆ 合成siRNA：将设计好的siRNA通过化学合成方法制备出来，并进行纯化和浓缩。通常选择购买现成的siRNA，也可以使用自行合成的siRNA。

☆ 细胞培养：将所需的受体细胞培养到适当的数量和密度。在转染前应确保细胞处于快速增长期，并且细胞状态良好。

☆ 转染siRNA：根据转染试剂说明书或实验室标准操作流程，将siRNA转染到受体细胞中。

☆ 鉴定：转染后需要对转染效率进行鉴定，一般是qPCR/WB对定量目标基因表达水平进行验证。

二、转染的类别

① siRNA概念及转染作用

siRNA，即小干扰RNA，是一种长度约为21-25个核苷酸的双链RNA分子。在转染这一步骤中，siRNA发挥的作用是诱导靶基因的沉默，进而抑制蛋白的表达。具体来说，当siRNA进入细胞后，它能够与细胞内的mRNA(信使RNA)结合，导致信使RNA的降解，从而阻止特定蛋白质的翻译。由于这种机制，siRNA在基因治疗和药物研发中具有广泛的应用前景，包括但不限于基因沉默、基因敲除、基因修饰、病毒抑制、细胞治疗以及疫苗研发等。

②DNA概念及转染作用

DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA转染是指将外源DNA分子导入真核细胞的过程，它是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。通常用于基因表达和蛋白质合成的研究。

③mRNA概念及转染作用

mRNA，全称为信使RNA，是由DNA上的基因信息转录而来的一种核酸分子。在细胞内，mRNA负责将DNA上的遗传信息转录成可读取的RNA序列，并传递给核糖体，以便合成蛋白质。mRNA的转染作用是指将体外合成的mRNA通过某种方式导入到细胞内，利用细胞内的翻译系统将mRNA翻译成目标蛋白质。这种技术被广泛应用于生物医药领域，如mRNA疫苗的研发和mRNA药物的生产。

三、常用于转染的细胞

常用于转染的细胞有原代细胞、原代细胞衍生物、肿瘤细胞系、幼仓鼠肾细胞(BHK-21)、人胚肾细胞(HEK-293)、人胚肺细胞(HEL)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、大鼠肝细胞、神经元细胞等。

需要注意的是，不同的细胞类型具有不同的转染效率和特点，实验人员需要根据具体实验需求和细胞特点选择适合的转染方法和技术。

四、常见实验问题

1.没有生成高效率的DNA转染试剂复合物

没有生成高效复合物的因素有很多。首先，可能是没有选对合适的转染试剂。挑选转染试剂时应考虑基因的种类及分子量等因素。其次，有的转染试剂对血清的影响很大，应在无血清情况下进行转染。使用Golden Tran系列转染试剂无需考虑血清对转染体系的影响，可在含血清培养基中进行转染。

2.转染效率低

影响细胞转染效率的因素有很多。首先，与所转染细胞有关，有的细胞容易转染，如HeLa、B16F10、293T等。有的细胞不易转染，如4T1、NIH3T3、BMDC等。其次，与转染试剂的用量及与DNA的比例有关，在最佳的转染比例附近可以达到最佳的转染效果。最后，没有使用最适宜的细胞密度，应根据各种转染试剂的说明书中推荐的细胞密度进行细胞接种，更有利于提高转染效率。

3.使用错误的转染操作步骤

无论使用哪一款基因转染试剂，都应严格按照该转染试剂的说明书进行操作，其中包括转染试剂的用量、基因用量、最佳转染比例、孵育时间、检测时间等重要因素。

4.细胞毒性大

导致转染时细胞毒性大的因素有很多，例如DNA的用量过大、转染试剂的用量过大、转染时细胞状态较差以及培养基中抗生素的加入等。建议严格按照所选择转染试剂的说明书进行操作，以避免细胞毒性大的问题。

5.转染效果不稳定，不能重现

转染效果不稳定一般与两个因素紧密相关，一个是转染试剂的稳定性，另一个是基因的稳定性。转染试剂应按照说明书建议的保存温度及条件进行保存。如使用脂质体类的转染试剂，则不建议反复冻融，会引起该转染试剂结构上的变化。基因如短时间内连续使用，可放置于4℃保存。若超过10天不使用，建议置于-20℃或-80℃长期储存以降低核酸的降解速度。

6.转染试剂有时呈云雾状浑浊

如发现转染试剂出现云雾状浑浊应立即联系客服人员。基因转染试剂一般都呈清澈透明状态，呈云雾状浑浊可能是由于转染试剂发生了污染或储存温度太低，请务必按照试剂说明书要求的温度进行储存。如出现此现象，建议温浴10分钟后，观察是否澄清。

7.转染复合物出现沉淀

当转染试剂和基因的用量都高于说明书用量，或复合物的孵育体系体积小于说明书建议时，由于体系中过量的电荷发生了聚集会导致体系中的复合物出现沉淀。建议要严格参考说明书的用量进行转染。

8.siRNA转染时，基因沉默效率不够高

影响siRNA沉默效率的因素很多，如基因本身是否被环境中的RNA酶污染降解?或所使用的细胞是否为难转染细胞?以及是否按照说明书建议的用量进行了操作等。首先应该选择合适的siRNA基因转染试剂，确保细胞密度在60-70%之间，并严格按照说明书建议的用量去使用操作。

9.DNA-siRNA共转染时，基因沉默效率不够高

当细胞同时转染DNA和siRNA时，建议使用分别转染的方式进行。即使用基因转染试剂分别与DNA和siRNA进行复合，再将两个复合物体系分两次分别加入到同一个装有细胞的实验孔中。因DNA和RNA的转染机理不相同，如只想使用一种转染试剂同时转染两种基因，建议一定要使用通用型基因转染试剂，如Golden Tran系列的DR产品，既可以转染DNA又可以转染RNA。

五、转染常用试剂推荐

博纳创源代理的转染试剂种类多，不仅有DNA专用转染试剂，RNA专用转染试剂，还有针对DNA、RNA通用型转染试剂，mRNA专用转染试剂，还有专门针对悬浮细胞和难转细胞的专用转染试剂以及病毒包装专用转染试剂，体内专用转染试剂和mRNA肌肉注射专用转染试剂等，与其它转染试剂相比，具有不受血清影响、毒性低、稳定性好、转染简单易行、重复性好等优点。