流式胞内及核内蛋白染色方案

• 制备单细胞悬液

•[可选]阻断Fc受体(10-20分钟)

• 加入表面蛋白的抗体并2-8°C孵育(30分钟)

• 用流式细胞染色缓冲液洗涤(1-2x5分钟)

•[可选]细胞活性染料染色细胞(20-30分钟)

•[可选]使用1X红细胞裂解液或1X一步法固定/裂解液裂解红细胞(10-20分钟)

• 固定细胞并破膜(30-90分钟)

• 用1X破膜液洗涤(1x5分钟)

• 加入细胞内蛋白的抗体并2-8°C孵育(30-60分钟)

• 用1X破膜液洗涤(1-2x5分钟)

• 在流式细胞染色缓冲液中重悬细胞

• 使用流式细胞仪分析细胞

流式细胞术中的细胞内蛋白染色

对细胞内蛋白质进行染色时，必须考虑到它在细胞内的定位，因为 这关系到实验方案和固定破膜剂的选择。

方案A：胞浆蛋白的两步法方案

材料

• 12x 5mm流式管

• [可选] 细胞活性染料

• 荧光直标抗体

• 细胞内固定&破膜液试剂盒

• 流式细胞染色缓冲液

• 细胞刺激混合液(加蛋白质转运抑制剂)

• 蛋白转运抑制剂混合液

• Brefeldin A 溶液

• 莫能菌素溶液Monensin

缓冲液和溶液的制备

将1体积10X浓缩液与9体积蒸馏水混合，制备1X的破膜缓冲液。

每份样本需要8.5mL的1X破膜液。

实验步骤:12X75mm流式管中的实验操作

1. 制备单细胞悬液。

2. [可选] 细胞活性染料染色细胞。

3. 进行细胞表面染色。

4. 最后一次洗涤后，弃上清，并脉冲式涡旋样本，直到细胞团块完

全分离。通常残留液量大约为100ul。

5. 加入 100ul IC 固定液固定细胞，然后脉冲式涡旋混匀。

6. 室温避光孵育20-60分钟。

7. 加入 2m1X破膜液，室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

8. 重复第7步。

9. 加入100ul 1X 破膜剂重悬细胞。加入荧光直标抗体，室温避光孵

育20-60分钟。

10. 加入2mL 1X 破膜液，室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

11. 重复第10步。

12. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬染色的细胞。

13. 使用流式细胞仪分析样本。

方案B：胞内(核内)蛋白的一步法方案

材料

• 12x75mm流式管

• [可选]细胞活性染料

• [可选]正常小鼠血清

• [可选]正常大鼠血清

• 荧光直标抗体

• Foxp3/ 转录因子染色缓冲液试剂盒

• 流式细胞染色缓冲液

缓冲液的制备

• 将 1 体积Foxp3固定/破膜浓缩液与三体积Foxp3固定/破膜稀 释液混合在一起，制备新鲜的Foxp3固定/破膜工作液。如果在 流式管中进行染色，则每个样本需要1ml工作液。

• 将 1 体积10X破膜缓冲液与9体积蒸馏水混合，制备1X的破膜缓 冲液。如果在流式管中进行染色，则每个样本需要8.5 ml工作液。

方案B1：12 x75mm流式管中的实验操作

1. 制备单细胞悬液。

2. [可选]细胞活性染料染色细胞。

3. 进行细胞表面染色。

4. 最后一次洗涤后，弃上清，并脉冲式涡旋样本，直到细胞团块完全分离。通常残留液量大约为100ul。

5. 每管加入1mL 1X Foxp3 固定/破膜缓冲液并脉冲式涡旋。

6. 2-8°C 或室温避光孵育30-60分钟。(小鼠样本可在2-8°C避光贮藏18小时)。

7. 每管加入2mL 1X破膜液，室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

8. [可选] 重复第7步。

9. 在残留的1X破膜液中重悬细胞。倒出上清液后大约残留100ul。

10. [可选] 向细胞中加入2%正常小鼠/大鼠血清进行封闭，室温孵育15分钟。

11. 不用洗涤，向细胞中加入荧光直标抗体，室温避光孵育至少30分钟。

12. 每管加入2mL 1X破膜液，室温400-600xg离心5分钟，弃上清。

13. 重复第12步。

14. 加入适量的流式细胞染色缓冲液重悬染色的细胞。

15. 使用流式细胞仪分析样本。

一般注意事项

1. 为了使荧光结合抗体性能达到最佳，应该将其2-8°C避光保存，禁止冷冻。

2. 使用之前应快速离心抗体瓶，确保抗体都在管底。不建议涡旋抗体瓶。

3. 除方案中明确指出以外，全部染色均在冰上或2-8°C下完成，尽量避光。

4. 细胞内抗原的固定和破膜步骤可能会改变细胞蛋白质的散射光信号，可能也会增加非特异性背景染色。在流式染色液中加入BSA或胎牛血清(FCS)等，有助于降低这种非特异性背景。建议使用细胞活性染料(FVD)，有助于去除死细胞的影响。